脱细胞真皮与异体巩膜在眼睑重建中的实验研究

发布时间：[2014-06-05]

 

 眼科研究2003年6月第21卷第3期
 
脱细胞真皮与异体巩膜在眼睑重建中的实验研究
 
顾建军，陈家祺，彭鸿钧，黄 挺，陈龙山，周世有 何玉良
 
【摘要】 
目的：了解脱细胞真皮植入兔眼睑后的组织相容性，比较脱细胞真皮与异体巩膜替代睑板后的组织转归。
方法：16只新西兰白兔，随机平均分成两组，在去除右下睑5mm×10mm的全层睑板后，分别植入脱细胞真皮和异体巩膜，观察大体情况和血液中免疫学指标的改变，分别于术后1、4、8、12周取出植片，光镜俭查组织学的改变，取第4周的植片做免疫组化检查。 
结果：脱细胞真皮植入眼睑后结膜充血水肿消退较快，无植入物排斥，两组血液中抗体和cD-4，CD-8细胞的改变无明显差异，组织学检查显示脱细胞真皮引起的免疫和炎症反应轻微。作为一种生物支架，可以引导受体新生血管和胶原纤维的长入。 
结论：脱细胞真皮在植入兔眼睑后有较好的组织相容性，并可引导新生胶原的生长，起到替代睑板的作用。
关键词  脱细胞真皮 异体巩膜 眼睑重睑
 
在眼睑重建手术中，睑板缺损的修复，可用自体或异体组织，也可用组织替代物修复。脱细胞真皮取材于新鲜尸体皮肤，经过特殊的处理方法使皮肤中主要引起免疫反应的细胞成分脱去，留下基底膜和真皮中的胶原基质。脱细胞真皮在眼睑重建中的实验研究国外仅见1篇报道，且未能区分出脱细胞真皮组织和新生胶原组织。本研究应用脱细胞真皮和较为常用的睑板替代物异体巩膜植入缺损
睑板的兔眼睑中，观察大体的和组织学方面的变化。
 
一、材料与方法
 
1. 新西兰白兔脱细胞真皮(ReDerm)和异体巩膜的制作
1.1.脱细胞真皮的制作供体新西兰白兔于手术前1周单独喂养，术前1 d脱毛。术中乙醚麻醉，碘酒酒精常规消毒，铺巾，切出全厚皮片，剪去皮下组织，经大量消毒生理盐水冲洗后用5 000 μg／ml庆大霉素、1 000 μg／ml多粘菌素溶液浸泡2次，每次15 min，然后使用常规固定剂(戊二醛等)，对皮肤的细胞外基质进行交联，无菌条件下将皮肤置入高渗盐水中24 h，使表皮与真皮组织的连接松解，用自行配制的脱细胞液(胰蛋白酶和EDTA鳌合剂)脱去细胞，用DNA酶、RNA酶等对细胞成分进行第2次消化脱去，生理盐水冲洗后，进行十冻硬化处理(专利待申请，北京桀亚莱福生物技术有限责任公司合作)。
1.2 异体巩膜的制作 新西兰白兔处死后行眼内容摘除术，然后断直肌将巩膜壳取出，充分去除巩膜上的色素和其他粘连组织，然后将巩膜壳经大量消毒生理盐水冲洗后用5000 μg／ml庆大霉素、1000μg／ml多粘菌素溶液浸泡2次，每次15min，放入95％的酒精脱水，使用前1d再放人75％的酒精消毒，然后用生理盐水充分洗净后行睑板替代手术．
2. 动物：成年健康新西兰白兔l6只，全部为雌性，体重2~3 kg。第1组8只，植入脱细胞真皮，第2组8只，植入异体巩膜。仅右眼手术。文验动物由巾山大学动物实验中心提供。动物级别：一级
3. 手术方法:所有手术由同一实验者完成。常规消毒铺巾，结膜囊滴0．5％丁卡因表面麻醉，用1：l 000升汞和生理盐水洗眼，肌内注射异丙嗪25 mg／kg和氯胺酮50 mg／kg全身麻醉。下眼睑用l％ 利多卡因及l：100000肾上腺素行局部浸润麻醉，距睑缘2mm平行睑缘切开睑结膜长l2 mm。向下分离结膜，游离出睑板，全层切除中央睑板10mm X 5 mm，植入睑板替代物(脱细胞真皮或异体巩膜)，大小为10mm X 5mm，其中脱细胞真皮基底膜面朝向结膜。植入前先将供体浸于庆大霉素溶液中5 mill，植片与残存睑板用8-0可吸收线间断缝合8针，如下方无睑板可将供体与下睑缩肌断端缝合，将结膜分离后移行覆盖于植片表面，用10-0线间断缝合同定2针。结膜下注射庆大霉素0．5万u，局部涂四环素可的松眼膏。肌内注射庆大霉素2万U至术后第3 d。术后第4 d用新霉素滴眼液点眼，每日4次，连续3周(图1)。
4．术后观察
4．1 大体观察 术后每日观察眼睑有无睑缘切迹，内外翻和结膜切口对合情况；有无植片暴露，排出，感染及角膜情况；有无睑球粘连，下穹隆缩窄；观察眼球运动。每周拍照1次。
4．2 体液免疫的观察分别于术后4周、8周抽兔耳静脉血3 ml于抗凝管内，放人I D4—2A离心机(北京医用离心机厂)以2 500 r／min离心15 mn，取上方血清放人Array 360 system(美国贝克曼公司)作免疫球蛋白和补体定量分析。
4．3 细胞免疫的观察 流式细胞仪是美同BECKMAN-COULTER(贝克曼一库尔特)公司生产，空白对照试剂鼠IgG1-FITC、鼠抗兔CD-4-FITC、CD-8-FITC均为美同Antigenix America公司提供。操作方法：
(1)标本制备：每份标本编两支试管，l号管加入两种l0m1对照试剂，2号管加入CD-4、CD-8各10m1，每管分别加入全血10m1，室温(18～25℃)中孵育15min。然后把试管放人Q-prep标本制备仪(美同BECKMAN-COULq Et1)上，自动将标本溶红血球，同定，1 500 r／ llln离心5 mill，去上清后加300 1 PBS待上机。
(2)上机：激 管预热30 mill后JL}J荧光微球(美国BECKMAN-COULTER公司)调整仪器，使各放大器接收的信号的HCF值<2％，以对照管作为空白定标，计算5 000个淋巴细胞，记录标本的阳性细胞百分率。
4．4 动物处死方法、时问与取材 从兔耳缘静脉注射空气，分别于术后l、4、8、l2周处死动物，每次每组2只，取出带植片的眼睑后放入10％ 甲醛中固定。然后行HE染色检查 另外将第4周取出的植片切取一半做免疫组化检查。
4．5 免疫组化检杳 直接法荧光 色免疫组织化学法(冰冻切片)
(1)动物同定：经左心室至升主动脉穿刺，用生理盐水快冲血管床，后用含4％ 多聚甲醛的0．1％mol／L的磷酸缓冲液(pH 7.4.4℃ )灌注同定，时间约1 h。
(2)将切取的兔眼睑放入原同定液后同定2 h，后入20％ 的蔗糖缓冲液过夜。将标本放入冰冻切片机(SHANDONG，美国)快速冰冻切片，厚度为4μm,4℃冷丙酮同定10min，PBS浸洗5 min(0．01 mol／LPBS，pH =7.2)。
(3)滴加标记荧光素的抗体(1：10)，分别为CD-4-FITC和CD-8-FITC，30min，室温置入湿盒内，防止干燥。PBS洗涤，倾玄存留的荧光素抗体，用PBS洗涤10 rain x 3次，厢10％缓冲甘油封片，在Olympus荧光显微镜下观查结果。
 
二、结果
 
1． 脱细胞真皮材料分析：经处理后的兔脱细胞真皮外观呈淡黄白包，坚韧，适当复水后颜色变白，质地柔韧，口丁任意裁剪成不同形状，厚度为0.5～0.6 mm 可分辨出脱细胞真皮由光滑及较粗糙的两面组成，其中光滑面为基底膜层，较粗糙面为真皮面层。
2． 动物实验结果
2．1 大体观察 植入供体后兔嘘结膜水肿、充ml平均消退时间脱细胞真皮组为术后5d，异体巩膜绢为术后9d两组植入后眼睑未见睑缘切迹，睑球粘连形成，角膜染色阴性。均无植入物排斥和暴露现象。术屙第12周时触摸兔眼右下脸发现脱细胞真皮组可感觉到柔韧的眼睑后层．而异体巩膜组眼睑后层已显得较为柔软。
2. 2 两组术后血液免疫球蛋白及补体的比较用配对f检验发现各组抗体及补体竹•术后4周、8周的两组数值无显著性差异(P>0 05)
2．3 两组术后血液CD-4，CD-8 胞的比较 用配对t检验发现各组CD-4、CD-8细胞在术后4周、8周的两组数值无显著性差异(P>0.05)。
2．4 HE切片检查
(I)脱细胞真皮组：1刷时脱细胞真皮植片交界处有轻度的淋巴细胞浸润 另外植片已有广泛晰积的纤维母细胞进八，无胶原结构破坏溶解现象(图2) 4周时植片外侧有9～l0层新生胶原纤维形成，排列较整齐，内有纤维母细胞，植片交界处 f见少量的淋巴细胞(21／镜野)和嗜伊红细胞(3／镜野)，开始有新生血管长人植片内，植片巾央为已有少量淋巴细胞浸润的胶原组织(图3)。8周时植片已有一部分被带纤维母细胞的胶原纤维代替，此时胶原排列较疏松．中间有少量慢淋巴细胞，新生血管已长入植片中央区。植片与周围组织没有包膜样结构形成12周时植片已大部分被排列较紧密整齐、中间夹少量纤维母细胞的新生胶原组织代替，胶原排划方向与结膜面相平行．很少淋巴细胞．手术I五域的结膜组织中可见大量空泡状的杯状细胞 、而此时可见脱细胞真皮植片自身的胶原组织排列没有一定的方向性(图4)。
(2)异体巩膜组：1周时异体玑胰植片交界处有较多的淋巴细胞浸润．少量嗜伊红细胞和中性白细胞．植片中央为无纲胞浸润的胶原组织。4周时植片交界处可见大量密集的淋巴细胞(126／镜野)．较多的噬伊红细胞(8／镜野)，植片边界处图1  在去除部分睑板的兔眼下睑中植入脱细胞真皮  图2 1周时脱细胞真皮植片．已有广泛面积的纤维母细胞进入（箭头）（HE×33周时植片外侧箭头示有9-10层新生胶原纤维彤腼 （HE×66)  图4  12周时植片(黑箭)已大部分被排列较紧密整芹，中间夹少量纤维的新生胶原组织（白箭）代替（HE×33） 
图5  4周时异体巩膜植片交界处可见大量密集的淋巴细胞（HE×66)   图6  12周时异体巩膜植片仍有车 
多淋 细胞浸润（HE x 33)部分胶原结构不清．未植片外侧新生胶原形成．此时植片中央仍为排列较整齐的胶原纤维，很少淋巴细胞(图5)。植入后8周，整个植片内仍见较多的淋巴细胞(56／镜野)浸润，新生血管长入，未见有植片外的胶原纤维层增厚。植入后12周，淋巴细胞浸润减少，植片范同内为排列较疏松的胶原纤维，与结膜而平行，厚度较原来组织变薄，胶原组织ff1问有新生毛细血管，仍未 有明 的新生胶原纤维(图6)。

 
2．5 用荧光 微镜对植入物 域的CD一4、CD培细胞计数，每个冰冻切片随机取5个 镜(×20)的细胞读数，然后平均，结果见表1，2。 

 
三、讨论
 
在眼睑重建手术中，通常将眼睑分为前后两层来分别进行手术修补，其巾后层为睑板和结膜组织。理想的眼睑后层替代物应与睑板一结膜复合体具有相似的厚度、表面性质以及弹性，另外，供体必须容易获得，手术容易操作，炎症反应轻微。作为一种常用的移植材料，异体巩膜相对容易获得；避免第二手术切口及缩短手术时间亦是它的优点。但异体巩膜经过一段时间会收缩，并且容易降解 。我们所做的动物实验观察到巩膜植入后4周就有大量的淋巴细胞，较多嗜伊红细胞出现，部分胶原结构在细胞浸润下已变得不清楚，免疫组化检查显示相对于脱细胞真皮植片，异体巩膜植人物区域有较多的CD-4、CD-8罐细胞的浸润。虽然在我们的实验中示两组兔的全身免疫情况无明显差异性，但存局部植入物区域异体巩膜组则有较强的免疫和炎症反应，所以我们推测较强的免疫反应可能是引起皎原结构破坏，或至少影响了供体胶原及糖蛋白作为细胞外基质引导受体纤维母细胞浸入和新生胶原纤维牛长的过程。
自体游离硬腭黏膜为带黏膜的复合植片，与睑板一结膜复合体结构相似是它的优点，但陔手术需要第二手术切口，一般眼科医生对口腔解剖结构不很熟悉，另外带角化上皮的口腔黏膜对角膜也有一定的破坏作用。临床应用表明眼睑植入自体硬腭组织6个月后一般都有慢性刺激症状 。向非角化的黏膜上皮化生时间需要几个月以上。所以一般都应用于下眼睑的重建术。供材的组织病变也是一个不容忽略的问题，患者可出现口腔出血和不适症状，黏膜下的瘢痕收缩可影响平时的咀嚼活动 。
脱细胞真皮最初应用于治疗全层皮肤烧伤，体外实验显示该种材料可以很好地支持上皮在其表面生长 。脱细胞真皮已被推广应用于鼻中隔缺损的重建、修补硬脑膜及萎缩牙龈的组织填充等。由于脱细胞真皮具有基底膜面及真皮组织面两个部分，所以术中的植入物方向性变得很重要，脱细胞真皮的真皮面应与供血丰富的组织相接触，以利于植片的快速血管化，而基底膜面应与黏膜面连接，有利于黏膜上皮的移动和再分布。
脱细胞真皮有许多作为替代眼睑后层的优点，材料容易获得，避免了第二手术切口及缩短手术时间，经硬化处理的脱细胞真皮复水后具有较好的可塑性和弹性，另外光滑的基底膜面可使结膜上皮化快速进行。由于脱去了细胞成分，不仅引起的免疫反应很轻微，也大大减少了病毒寄宿的环境。在我们所做的短期观察巾，脱细胞真皮可起到支撑眼睑后层结构的作用。手术后反应轻，无排斥反应，也无扭曲、溶解现象。脱细胞真皮作为一种生物支架，保留了胶原纤维及小血管中的基质成分，这些些物质都有助于引导受体细胞和新生血管的长入，形成新的细胞外基质，从而取代脱细胞真皮。脱细胞真皮植入眼睑后的长期效果，还待临味方面的进一步观察。经过上述的动物实验，我们认为，脱细胞真皮可作为眼睑缺损修复术的睑板替代物，且修复效果良好，抗原性低的优越性。
 
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（收稿日期：2003-03-10）